蛋白质电泳试剂配制

1 蛋白质电泳试剂配制

1） 2M Tris-HCl(pH=8.8) 100ml

称24.2gTris-base 加50ml ddH2O,加浓HCl至pH=8.8（约4ml），加ddH2O定容至100ml。

2） 1M Tris-HCl(pH=6.8) 100ml

称12.1gTris-base 加50ml ddH2O,加浓HCl至pH=6.8（约8ml），加ddH2O定容至100ml。

3） 10%（W/V）SDS 100ml

称SDS10g，加ddH2O定容至100ml。

4） 50%（V/V）甘油 100ml

量取50ml100%甘油，加ddH2O定容至100ml。

5） 4×分离胶缓冲液100ml（B液）

75ml 2M Tris-HCl(pH=8.8) 1.5M

4ml 10%SDS 0.4%

21ml ddH2O

4℃保存

6） 4×堆积胶缓冲液100ml（C液）

50ml 1M Tris-HCl(pH=6.8) 0.5M

4ml 10%SDS 0.4%

46ml ddH2O

4℃保存

7) 丙烯酰胺储存液 100ml（A液）

30%（W/V）丙烯酰胺 29.2g

0.8% 甲叉双丙烯酰胺 0.8g

加ddH2O40ml缓慢搅拌至粉末完全溶解，定容至100ml，过滤，4℃保存。

8） 5×样品缓冲液10ml

600ul 1M Tris-HCl(pH=6.8) 60mM

5ml 50%甘油 25%

2ml 10%SDS 2%

500ul 2-巯基乙醇（DTT） 14.4 mM

1ml 10%溴酚兰

900ul ddH2O

4℃保存

9） 10%过硫酸铵（APS）

称0.1294g ddH2O溶解，-20℃保存。

10）5×电泳缓冲液

Tris-base 15g 25 mM （1×）

甘氨酸 94g 192 mM（1×）

SDS 5g 0.1% （1×）

加ddH2O至1L，pH=8.3左右，室温长期保存。

11）考马斯亮兰染色液

考马斯亮兰 R-250 1.0g

甲醇 450ml

HAc 450ml

ddH2O 100ml

定容过滤，室温保存。

12）1%（W/V）溴酚兰 25ml

称250.3mg溴酚兰，加ddH2O至25ml，搅拌至完全溶解，过滤除去未聚合的燃料。

13）考马斯亮兰脱色液 500ml

甲醇 50ml

冰醋酸 50ml

ddH2O 400ml

室温保存。

2 蛋白质定量溶剂

14）BSA 1mg/ml 3ml

称取3mg用ddH2O溶解。

15）稀释染色液 250ml

浓染色液 50ml

ddH2O 220ml

过滤后棕色瓶4℃保存

16）实验用缓冲液 Tris-HCl 50 mM（pH=8.0）

2M Tris-HCl(pH=8.8) 1.25ml，稀释到50ml

3 蛋白质样品的定量

1） 准备染色剂

将ddH2O与Biorod按4︰1稀释染色剂过滤，除去粉状物，棕色瓶4℃保存（有毒）。

2） 准备8份蛋白质标准样品比色管

3） 吸取标准样品（终体积为100ul）分别加入干净干燥的比色管。

4 蛋白质电泳

1） 分离胶10ml（8%适合分离范围30-120KDa

A液 2.7ml

B液 2.5ml

ddH2O 4.8ml

10%Aps 50ul

TEMED 5ul

灌注2块胶块，每个注入3.4ml水封，凝50min以上（37℃约30min），水浅分层后倾斜凝胶板，用滤纸吸尽水层（滤纸不要接触到胶层）。

2） 分离胶10ml（12%适合分离范围15-60KDa）

A液 4ml

B液 2.5ml

ddH2O 3.5ml

10%Aps 50ul

TEMED 5ul

分离胶4℃下可储存1周。

3） 堆积胶（5%）4ml

A液 0.67ml

C液 1ml

ddH2O 2.3ml

10%Aps 50ul

TEMED 5ul

灌注2块胶块，每个注入1.3ml水封，凝30min以上（37℃约18min）。