一种乳酸杆菌的转化方法[发明专利]

[12]发明专利申请公布说明书

[21]申请号200710159352.1[51]Int.CI.

C12N 13/00 (2006.01)C12N 1/20 (2006.01)C12R 1/225 (2006.01)

[43]公开日2008年7月23日[22]申请日2007.12.30[21]申请号200710159352.1

[71]申请人侯喜林

地址163319黑龙江省大庆市高新技术开发区黑

龙江八一垦大学动科院转[72]发明人侯喜林 余丽芸 朴范泽 刘建柱

[11]公开号CN 101225381A

[74]专利代理机构大庆市远东专利商标事务所

代理人马洪发

权利要求书 1 页 说明书 10 页

[54]发明名称

一种乳酸杆菌的转化方法

[57]摘要

本发明的一种乳酸杆菌的转化方法是通过乳酸杆菌感受态细胞制备和电转化实现的，具体操作步骤如下：活化乳酸杆菌，将其过夜静止培养，再接种至MRS培养基上，加入氨苄青霉素，培养至OD600＝0.5～0.8；再离心分离，用PEB清洗、悬浮制得乳酸杆菌感受态细胞；再将质料加入到乳酸杆菌感受态细胞并注入电极杯中，冰浴1分钟，电击4～5毫秒后，加入MRS培养基、37℃静止培养3～4小时；再将培养液涂布含有氯霉素的MRS固体培养基上，37℃培养24～36小时，即完成乳酸杆菌的转化。本发明乳酸杆菌的转化方法重复性好、转化效率高。

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权 利 要 求 书

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1.一种乳酸杆菌的转化方法，其特征是通过乳酸杆菌感受态细胞制备和电转化实现的，具体操作步骤如下：

a、活化乳酸杆菌，在36～38℃时静止培养16～36小时； b、取活化乳酸杆菌接种到MRS培养液中、体积为MRS的1～3％，恒温36～38℃静止培养2～4小时后，向每毫升培养液中加入15～25μg氨苄青霉素，继续静止培养1小时至OD600＝0.5～0.8；

c、将b步骤制得的乳酸杆菌培养液移至离心管中、在4℃、7000转/分钟的条件下离心分离8～12分钟，弃除上清液，取得细菌沉淀物； d、将c步骤制得的细菌沉淀物用0～4℃的PEB清洗、用量是b步骤中每100ml的MRS培养液用PEB0.8～1.2ml，经c步骤离心分离取得沉淀物；再用0～4℃的PEB悬浮细菌沉淀物、用量是b步骤中每100ml的MRS培养液用PEB0.8～1.2ml，再经c步骤离心分离取沉淀物，最后用PEB1.8～2.2ml悬浮细菌沉淀，冰浴下无菌分装，每管40～100μl，即制得乳酸杆菌感受态细胞溶液； e、将质粒DNA加入到d步骤制得的乳酸杆菌感受态细胞溶液中、体积用量为乳酸杆菌感受态细胞溶液的20～30％、置冰浴中8～12分钟，再移入电极杯中继续冰浴1～3分钟；

f、在电极杯中施用25μF、2～2.3KV、200Ω条件下电击乳酸杆菌感受态细胞溶液、时间为3～6毫秒；

g、向f步骤制得的乳酸杆菌感受态细胞溶液加入冰冷的MRS培养液、休积为乳酸杆菌感受态细胞溶液的22～26倍，36～38℃静止培养2～5小时； j、吸取g步骤制得的培养液涂布在MRS固体培养基上、MRS固体培养基中含与质粒抗生素抗性序列相对应的抗生素4～8μg/ml，在36～38℃下培养24～36小时，即制得转化子，完成乳酸杆菌的转化。

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说 明 书

一种乳酸杆菌的转化方法

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技术领域

本发明涉及一种乳酸杆菌的转化方法。 背景技术

乳酸菌是一类能利用可发酵糖类产生大量乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布广泛，可寄居于人和各种动物的肠道及其它器官内。在土壤、植物根部和许多人类食品、动物饲料，还有自然界的湖泊和河水、污泥以及一些临床样品中都发现有乳酸菌的存在。乳酸菌在与人类生活密切相关的工业、农业和医药等重要领域有很高应用价值。相当多的乳酸菌对人、畜健康起着有益的作用。乳酸菌主要包括23个属，其中与分类密切相关的有革兰阳性兼性厌氧球菌中的乳球菌属(Lactococcus)，革兰阳性无芽胞杆菌中的乳杆菌属(Lactobacillus)以及不规则的专性厌氧菌中的双歧杆菌(Bifidobacterium)。乳杆菌在农业、食品领域具有重大的经济意义以及对动物和人体健康公认的重要性，越来越引起人们的关注。几个世纪以来，乳杆菌作为重要的益生菌已广泛地应用于食品及饮料加工业，其生物学特性为棒状，厌氧或微需氧，属非致病菌。以乳杆菌作为发酵菌的食品工业所创造出的经济价值占全球总的发酵类食品的20％。同时乳杆菌也被广泛用于肠、肉类食品的加工和保鲜。乳杆菌通过重建肠道菌群平衡，从而有利于人类及某些动物宿主恢复并提高健康状态。对于其发挥作用的机制现已研究得较为明确，主要有以下几个方面：①控制肠道感染；②增加某些食物的营养价值；③控制血清胆固醇水平；④改善乳糖代谢；⑤诱导体内特异性及非特异性免疫；⑥抗肿瘤活性。有关它的选种、生物学特性、代谢、生理、遗传等方面的研究，以及以改造这些菌株特性为目的的研究近年来逐渐增加。通过在大肠杆菌中

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克隆和表达DNA片段，再借助转化，将外源性DNA导入乳杆菌中，使之稳定地在乳杆菌中复制和表达。目前，几乎所有的乳杆菌中都可以进行转化。最近研究方法已经发展到将基因插入到染色体特定部位，使基因有目的地突变。乳杆菌具有十分重要的生理作用及经济价值，因此近几十年来已广泛开展了对其定性、筛选、代谢、生理学及基因方面的研究，尤其是应用基因工程手段已将研究由原来的重点定性分类阶段转移到稳定转化及改善乳杆菌生物学性状的重点上来。根据一系列复制子构建的具广泛宿主范围的质粒载体系统已十分成功地转化乳酸菌并表达内源及外源基因。乳酸菌属是寄生在肠道内的正常易生菌属之一，乳酸菌表面表达的一些抗原，如肽聚糖，有天然免疫佐剂作用，对设计口服疫苗具有很大的吸引力。多个研究表明乳酸菌是良好载体，可有效地引起机体的免疫应答和免疫耐受。菌体表面展示表达特别引人注目，其原因主要为：(1)目前已有多种表面表达系统；(2)多肽抗原暴露于细胞表面是更容易被免疫系统识别；(3)菌体外膜蛋白、脂多糖、外毒素等是强免疫原，已经成功地制造成多种重组疫苗，细胞表面成分可对表达的外源抗原起免疫辅助作用。将疫苗产业化生产免疫饲料，动物在摄取营养的同时就预防了疾病，免疫简易便利，不需要人员培训和仪器设备。

自从1976年Chassy(Chassy BM，Gibson E，Giuffrida A.Evidence forextrachromosomal elements in Lactobacillus[J].J Bacteriol.1976 Sep；127(3)：1576-1578.)首次发现乳杆菌属质粒以来，人们陆续从植物、肉、腊肠、发酵剂、胃肠道和菌株中分离出各种不同的质粒。许多乳杆菌带有1个或多个质粒。但保加利亚乳杆菌不存在内源性质粒是1个普遍存在的规律，而且对外来的自我复制的染色体外物质具有相对抵抗性。用DNA2DNAc杂交和/或核苷酸序列分析证实，各种质粒之间具有不同程度的同源性，从而说明质粒间的横向传递和

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重组是相当频繁的。虽然质粒普遍存在乳杆菌中，但对这些质粒的功能了解极少，这一点不同于乳球菌。最近几年开展了有关质粒与细菌特性关系的广泛研究，从中发现了质粒与某些表型，如抗药性，N2乙酰氨基葡萄糖减缓酸的形成，糖苷的代谢、糖代谢、氨基酸代谢、细菌素产生与免疫、合成粘膜相关外，乳杆菌的大多数质粒，尤其是小质粒都是隐蔽性的。

乳酸杆菌的许多种类中均发现有质粒的存在。最早在1976年由Chassy及其同事发现。分离得到的质粒菌株来源于植物、肉类、青储饲料，发酵生面及消化道。研究中发现，很多种类的乳杆菌均具有1个或多个质粒谱。WangTT等WangTT，Lee BH.Plasmid in Lactobacillus[J].Crit Rev Biotechnol，1997，17(3)：227～272.)研究发现约有38％的乳酸杆菌中含有大小不等的质粒，约在112～150kb之间。且数量各异，1个或多个。小的质粒同其他革兰阳性菌的线型质粒具有高度的相似性。

一些乳杆菌质粒复制子宿主范围广泛，因而可在其他种类的革兰阳性菌及大肠杆菌中发挥作用。但大多数乳杆菌质粒均为隐蔽型。但有些质粒编码功能已经明确，并已应用于乳杆菌的鉴定、定型、载体构建及修饰中(Wang TT，LeeBH.Plasmid in Lactobacillus[J].Crit Rev Biotechnol，1997，17(3)：227～272.)。不同的研究者得到的质粒检测结果也不同。造成这个差异的关键在于不同的质粒提取方法。同时菌种来源不同也是一个方面。而Ruiz2Barba(Ruiz2Barba，JL，Piard JC，Jimenez2Diaz R.Related Articles Plasmid profiles and curing of plasmidsin Lactobacillus plantarum strains isolated from green olive fermentations[J].ApplBacteriol.1991 Nov；71(5)：417-21.)等在35株分离自橄榄的乳杆菌中均发现有不同大小的质粒存在。其中许多质粒的分子量较以前发现的要大得多。而分离自鸡、小鼠肠道内的乳杆菌株，质粒阳性菌株却较少。质粒也极少在保加利亚

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乳杆菌中发现。

由于乳杆菌中大部分质粒尤其是小质粒均属隐蔽型的，因此对这些质粒的功能知之甚少。大多数的乳杆菌质粒表现出了分离稳定性，尤其是小的隐性质粒较大质粒相对更加稳定。现已有多种乳杆菌质粒被提出及鉴定，如分离自植物乳杆菌的pLB4，pC30il，pLD1，p801422和pA1；分离自戊糖乳杆菌的p35322；分离自瑞士乳杆菌的pLJ1和希氏乳杆菌的LAB1000。质粒的大小都非常相似，在119～315kb。质粒pLEB579(219kb)被成功地用电穿孔转入来自于鸡小肠的4株野生型乳杆菌。转化效率虽低，但依然为食品级乳杆菌的基因工程奠定了基础(Beasley SS，Takala TM，Reunanen J，et al.Characterization and

electrotransformation of Lactobacillus crispatus isolated from chicken crop andintestine[J].Poult Sci.2004 Jan；83(1)：45-8.)。在另外的一个研究中，重组质粒在诱导条件下在植物乳杆菌中高水平表达了细菌素(Mathiesen G，Sorvig E，Blatny J，et al.High level gene expression in Lactobacillus plantarum using apheromone2regulated bacteriocin promoter[J].Lett Appl Microbiol.2004；39(2)：137-43.)。

由于乳杆菌广泛的工业用途和在医学上的重要意义，对乳杆菌分子遗传学研究成为焦点，特别是利用基因工程技术，以乳杆菌为载体携带外源基因(如抗原、酶、小肽分子等)到人和动物体内直接产生外源蛋白质。乳杆菌的遗传操作的先决条件是建立方便和可靠的转化方法。目前乳杆菌的转化方法有原生质体转化法和电击转化法。原生质体转化法最早出现，但具有繁琐、耗时和不稳定的缺点而被摒弃，乳杆菌的电击转化法取代了原生质体转化法，但是仍然不十分完善，尤其是重复性不好，转化率低。 发明内容

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本发明旨在于克服现有技术的不足，提供了一种乳酸杆菌的转化方法。 本发明的一种乳酸杆菌的转化方法，其特征是通过乳酸杆菌感受态细胞制备和电转化实现的，具体操作步骤如下：

a、活化乳酸杆菌，在36～38℃时静止培养16～36小时；

b、取活化乳酸杆菌接种到MRS培养液中、体积为MRS的1～3％，恒温36～38℃静止培养2～4小时后，向每毫升培养液中加入15～25μg氨苄青霉素，继续静止培养1小时至OD600＝0.5～0.8；

c、将b步骤制得的乳酸杆菌培养液移至离心管中、在4℃、7000转/分钟的条件下离心分离8～12分钟，弃除上清液，取得细菌沉淀物；

d、将c步骤制得的细菌沉淀物用0～4℃的PEB清洗、用量是b步骤中每100ml的MRS培养液用PEB0.8～1.2ml，再经c步骤离心分离取得沉淀物；再用0～4℃的PEB悬浮细菌沉淀物、用量是b步骤中每100ml的MRS培养液用

PEB0.8～1.2ml，再经c步骤离心分离取沉淀物，再用PEB 1.8～2.2ml悬浮细菌沉淀，冰浴下无菌分装，每管40～100μl，即制得乳酸杆菌感受态细胞溶液； e、将质粒DNA加入到d步骤制得的乳酸杆菌感受态细胞溶液中、体积用量为乳酸杆菌感受态细胞溶液的20～30％、置冰浴中8～12分钟，再移入电极杯中继续冰浴1～3分钟；

f、在电极杯中施用25μF、2～2.3KV、200Ω条件下电击乳酸杆菌感受态细胞溶液、时间为3～6毫秒；

g、向f步骤制得的乳酸杆菌感受态细胞溶液加入冰冷的MRS培养液、休积为乳酸杆菌感受态细胞溶液的22～26倍，36～38℃静止培养2～5小时； j、吸取g步骤制得的培养液涂布在MRS固体培养基上、MRS固体培养基中含与质粒抗生素抗性序列相对应的抗生素4～8μg/ml，在36～38℃下培养

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24～36小时，即制得转化子，完成乳酸杆菌的转化。

适用本方法乳酸杆菌转化效率达到每微克DNA可以获得500～2×10

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个转

化子。转化率高，重复性好，解决了长期以来乳杆菌转化无法获得转化子的局面，建立了乳杆菌的转化方法。

本发明乳酸杆菌的转化方法，优化的转化条件、重复性好、提高了转化效率。

具体实施方式

本发明所述的MRS液体培养基配方为：蛋白胨10克；牛肉膏10克；酵母粉5克；葡萄糖20克；K2HPO4 2克；柠檬酸氢二铵2克；乙酸钠5克；吐温80 1毫升；MgSO4.7H2O 0.58克；MnSO4.4H2O 0.25克；PH6.2～6.4；用灭菌的蒸馏水定容到1000毫升；或者商品化的MRS培养基直接用。

MRS体培养基制备方法：称取52.3gMRS肉汤培养基，15g琼脂粉溶于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，115℃15分钟高压灭菌，灭菌后待培养基冷却至50～60℃时，根据需要加入抗生素，比如：25～34μg/ml的氯霉素，摇动容器充分混匀。在无菌条件下，倾注16～20ml培养基到90mm培养皿中，冷却后即制得MRS固体培养基，4℃保存待用。

PEB配方为：蔗糖272mmol/L，MgCl20.5mmol/L，K H2PO4 0.5mmol/L.或272mmol/L蔗糖，MgCl20.5mmol/L，K2HPO4，PH7.4) 实施例1

a、活化乳酸杆菌，在36～38℃时静止培养16～36小时；

b、取活化乳酸杆菌接种到MRS培养液中、体积为MRS的1～3％，恒温36～38℃静止培养2～4小时后，向每毫升培养液中加入15～25μg氨苄青霉素，继续静止培养1小时至OD600＝0.5～0.8；

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c、将b步骤制得的乳酸杆菌培养液移至离心管中、在4℃、7000转/分钟的条件下离心分离8～12分钟，弃除上清液，取得细菌沉淀物；

d、将c步骤制得的细菌沉淀物用0～4℃的PEB清洗、用量是b步骤中每100ml的MRS培养液用PEB0.8～1.2ml，再经c步骤离心分离取得沉淀物；再用0～4℃的PEB悬浮细菌沉淀物、用量是b步骤中每100ml的MRS培养液用

PEB0.8～1.2ml，再经c步骤离心分离取沉淀物，再用PEB1.8～2.2ml悬浮细菌沉淀，冰浴下无菌分装，每管40～100μl，即制得乳酸杆菌感受态细胞溶液； e、将质粒DNA加入到d步骤制得的乳酸杆菌感受态细胞溶液中、体积用量为乳酸杆菌感受态细胞溶液的20～30％、置冰浴中8～12分钟，再移入电极杯中继续冰浴1～3分钟；

f、在电极杯中施用25μF、2～2.3KV、200Ω条件下电击乳酸杆菌感受态细胞溶液、时间为3～6毫秒；

g、向f步骤制得的乳酸杆菌感受态细胞溶液加入冰冷的MRS培养液、休积为乳酸杆菌感受态细胞溶液的22～26倍，36～38℃静止培养2～5小时； j、吸取g步骤制得的培养液涂布在MRS固体培养基上、MRS固体培养基中含与质粒抗生素抗性序列相对应的抗生素4～8μg/ml，在36～38℃下培养24～36小时，即制得转化子，完成乳酸杆菌的转化。 实施例2

本发明的一种乳酸杆菌的转化方法，其特征是通过乳酸杆菌感受态细胞制备和电转化实现的，具体操作步骤如下：

a、活化乳酸杆菌，在37℃时静止培养20小时；

b、取4ml的活化乳酸杆菌接种到200ml的MRS培养液中，恒温37℃静止培养3小时后，再加入4000μg的氨苄青霉素，继续静止培养1小时至OD600＝0.5～

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0.8；

c、将b步骤制得的乳酸杆菌培养液移至离心管中、在4℃、7000转速的条件下进行离心分离操作10分钟，弃除上清液，取得细菌沉淀物；

d、将c步骤制得的细菌沉淀物用4℃、2ml的PEB清洗2次，再经c步骤离心分离取得沉淀物；再用4℃、4ml的PEB悬浮细菌沉淀物，冰浴下，无菌分装40μl/管，即制得乳酸杆菌感受态细胞溶液；

e、将10μl的pLA-TGEVSa质粒DNA加入到d步骤制得40μl的乳酸杆菌感受态细胞溶液中、置冰浴中10分钟，再移入电极杯中继续冰浴1分钟；

f、在电极杯中施用25μF、2～2.3KV、200Ω条件下电击乳酸杆菌感受态细胞、时间为4～5毫秒；

g、向f步骤制得的乳酸杆菌感受态细胞溶液加入冰冷的MRS培养液950μl，37℃静止培养3～4小时；

j、吸取g步骤制得的培养液100μl涂布在MRS固体培养基上，MRS固体培养基含有6μg/ml氯霉素，在37℃时培养30小时后，经实测，可即制20000个转化子。 实施例3

本发明的一种乳酸杆菌的转化方法，是通过下列操作步骤实现的： a、活化乳酸杆菌，在36℃时静止培养16小时；

b、取1ml的活化乳酸杆菌接种到200mlMRS培养液中，恒温36℃静止培养2小时后，向每毫升培养液中加入3000μg氨苄青霉素，继续静止培养1小时至OD600＝0.5～0.8；

c、将b步骤制得的乳酸杆菌培养液移至离心管中、在4℃、7000转速的条件下进行离心分离8分钟，弃除上清液，取得细菌沉淀物；

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d、将c步骤制得的细菌沉淀物用0℃、1.6ml的PEB清洗两次，再经c步骤离心分离取得沉淀物；再用0℃、3.6ml的PEB悬浮细菌沉淀物，冰浴下，无菌分装40μl/管，即制得乳酸杆菌感受态细胞溶液；

e、将8μl的pMG36e或pLEM415或pE194质粒DNA加入到d步骤制得

40μl的乳酸杆菌感受态细胞溶液中，冰浴8分钟，再移入电极杯中继续冰浴1分钟；

f、在电极杯中施用25μF、2～2.3KV、200Ω条件下电击乳酸杆菌感受态细胞、时间为3毫秒；

g、向f步骤制得的乳酸杆菌感受态细胞溶液中加入冰冷的MRS培养液880μl、，36℃静止培养2小时；

j、吸取g步骤制得的培养液涂布在MRS固体培养基上、每毫升MRS中含有3μg红霉素，在36℃时培养26小时，经实测，可即制8000个转化子。 实施例4

本发明的一种乳酸杆菌的转化方法，是通过下列操作步骤实现的： a、活化乳酸杆菌，在38℃时静止培养36小时；

b、取3ml的活化乳酸杆菌接种到200mlMRS培养液中，恒温38℃静止培养4小时后，向每毫升培养液中加入5000μg氨苄青霉素，继续静止培养1小时至OD600＝0.5～0.8；

c、将b步骤制得的乳酸杆菌培养液移至离心管中、在4℃、7000转速的条件下进行离心分离12分钟，弃除上清液，取得细菌沉淀物；

d、将c步骤制得的细菌沉淀物用4℃、2.4ml的PEB清洗两次，再经c步骤离心分离取得沉淀物；再用4℃、4.4ml的PEB悬浮细菌沉淀物，冰浴下，无菌分装40μl/管，即制得乳酸杆菌感受态细胞溶液；

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e、将12μl的pLA-TGEVSbc或pLA-ETECF4 1或pLA-ETECK99质粒DNA

加入到d步骤制得40μl的乳酸杆菌感受态细胞溶液中，冰浴12分钟，再移入电极杯中继续冰浴3分钟；

f、在电极杯中施用25μF、2～2.3KV、200Ω条件下电击乳酸杆菌感受态细胞溶液、时间为6毫秒；

g、向f步骤制得的乳酸杆菌感受态细胞加入冰冷的MRS培养液1040μl，38℃静止培养5小时；

j、吸取g步骤制得的培养液涂布在MRS固体培养基上，每毫升MRS含有7μg氯霉素，在38℃时培养32小时，即制得转化子，经实测，可即制15000个转化子。

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